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El sustrato de la lipasa son los triglicéridos, que son moléculas de grasa compuestas por una molécula de glicerol unida a tres ácidos grasos. La lipasa actúa hidrolizando los enlaces éster de los triglicéridos para liberar ácidos grasos libres y monoglicéridos o diglicéridos. Esta reacción es esencial para la digestión y absorción de grasas en el organismo.